碳青霉烯类抗生素抗菌谱广泛，常用于耐药革兰阴性杆菌引起临床感染的治疗。然而，随着其在临床的广泛应用，耐碳青霉烯类肠杆菌目(carbapenem-resistant Enterobacterales, CRE)菌株逐年增多，已在全球范围内流行^[1]。目前针对CRE菌株感染的治疗，可选择的抗菌药物十分有限，编码碳青霉烯酶质粒的传播，有助于CRE的广泛流行，CRE感染的高发病率和病死率已成为全球公共卫生的主要威胁^[2]。碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制是产碳青霉烯酶，常见碳青霉烯酶主要包括KPC、NDM、IMP、VIM和OXA-48，其中最常见的是由bla_KPC编码的A类丝氨酸类酶KPC(Klebsiella pneumoniae carbapenemase)^[3-5]。由于碳青霉烯类抗生素耐药机制不同，不同抗菌药物对CRE菌株抗菌效果存在差异。本试验采用肉汤法测定最低抑菌浓度(MIC)，棋盘法进行联合药敏试验，时间-杀菌曲线和药物治疗菌株感染动物的试验方法，评价单用头孢他啶/阿维巴坦(CZA)及其与氨曲南(ATM)联合用药的体外杀菌效果和体内抗菌效果，为临床用药提供可靠依据。

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   菌株来源

收集2018—2022年蚌埠医科大学第一附属医院临床标本中分离的52株CRE(剔除同一患者相同部位分离的重复菌株)，包括29株肺炎克雷伯菌、20株大肠埃希菌、2株阴沟肠杆菌及1株黏质沙雷菌。主要分离自痰、血、脑脊液及尿标本，分布在重症监护病区、神经外科及呼吸科等。质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853来自国家卫生健康委临检中心。

1.1.2   仪器与试剂

菌株鉴定和药敏试验采用VITEK MS飞行时间质谱仪和VITEK 2全自动鉴定及药敏分析系统(法国梅里埃公司)。CZA(北京拉索生物科技有限公司)，ATM(上海源叶生物科技有限公司)。碳青霉烯酶检测试剂盒(天津一瑞生物科技股份有限公司)，MH琼脂及MH肉汤(英国Oxoid公司)。大蜡螟(中国天津惠裕德生物科技有限公司)，长度(20±5)mm，重量(250±50) mg。

1.2   方法

1.2.1   碳青霉烯酶检测

采用碳青霉烯酶检测试剂盒检测5种酶型：KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM。将纯培养菌株和样品处理液在EP管中充分混合，加载50 μL到检测条上。室温下放置15 min后，结果判读依据操作说明书，质控线(C线)区域一条红线，检测区域任何酶型出现一条或多条，即为标本含有相应的碳青霉烯酶。

1.2.2   MIC测定及联合药敏

采用微量肉汤稀释法测定CZA和ATM对52株CRE的MIC。棋盘稀释法检测联合药敏的分级抑菌浓度(FIC)，FIC=联合药物A的MIC/单独药物A的MIC+联合药物B的MIC/单独药物B的MIC，协同效应为FIC≤0.5，相加效应为0.5 < FIC≤1，无关效应为1 < FIC≤2，拮抗效应为FIC>2^[6]。结果判定根据2022版美国临床实验室标准化协会(CLSI)指南推荐的标准和折点。CZA的浓度范围为0.25/4~128/4 μg/mL(阿维巴坦的浓度固定为4 μg/mL)，ATM的浓度为0.06~128 μg/mL。

1.2.3   时间-杀菌曲线

选取9、19、37号对CZA敏感产KPC的肺炎克雷伯菌，根据CZA对产KPC菌的MIC，采用时间杀灭法检测CZA在0.5、1、2、4和8倍MIC时的杀菌效果。根据CZA与ATM联合药敏试验结果及文献推荐的方法^[7]，选取27、39、47号对CZA耐药产NDM大肠埃希菌，取对数生长期细菌，用无菌M-H肉汤配制浓度为1.0×10⁶ CFU/mL的菌悬液。细菌的M-H肉汤与单一或组合抗菌剂混合，并在35℃下连续振摇孵育过夜。不含抗菌药物的相同肉汤作为生长对照。在0、4、8、12和24 h对肉汤样品进行10倍系列稀释，每个稀释样本取100 μL接种在M-H琼脂平板上，重复试验3次，35℃过夜培养，进行菌落计数，取平均值。每毫升菌液计数表示为Nt，数据换算为Log₁₀ Nt。使用GraphPad Prism 5软件分析数据并绘图。

1.2.4   大蜡螟毒力试验

选取16、22、30号对CZA耐药产金属酶的菌株，以M-H肉汤中孵育的对数生长期细菌制备菌悬液，稀释为3个浓度梯度(1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵ CFU/mL)，将大蜡螟幼虫随机分为5组，每组20只幼虫，其中1~3组分别使用微量注射器注射相应浓度菌液10 μL，第4组为PBS对照组，注射PBS溶液10 μL，第5组为空白对照组，不做任何处理。将注射后的幼虫置于37℃培养箱孵育120 h，每24 h观察幼虫存活量。试验重复3次，计算每株菌的LD₈₀。

1.2.5   大蜡螟感染模型建立

根据毒力试验得到的结果，配制每株菌的80%致死剂量对应的菌液浓度，以此浓度配制菌液感染大蜡螟幼虫。试验分为5组，每组20只幼虫，第1、2、3组注射相应浓度菌液10 μL，第4组为PBS对照组，注射PBS溶液10 μL，第5组为空白对照组，不做任何处理。注射完毕后将幼虫置于37℃培养箱中孵育2 h，然后对试验组幼虫模拟人体剂量一次性给予10 μL的抗菌药物(CZA和ATM的人体剂量分别为50、100 mg/kg)。给第1组幼虫注射相应浓度的CZA 10 μL，给第2组幼虫注射相应浓度的ATM 10 μL，给第3组幼虫注射相应浓度的CZA和ATM联合药物10 μL，给第4组幼虫注射PBS溶液10 μL，第5组幼虫不做任何处理。将注射后的幼虫置于37℃培养箱继续孵育120 h，每24 h观察并记录每组幼虫死亡数量，比较存活率。

1.3   统计学方法

应用SPSS 22.0软件进行统计学分析，对于生存率曲线比较，使用Log-rank (Mantel-Cox)检验分析结果。P≤0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   52株CRE碳青霉烯酶酶型及CZA的MIC值

52株CRE共检出产KPC酶23株，产NDM酶24株，产IMP酶1株，产KPC+NDM菌3株，产KPC+IMP酶1株。23株产KPC酶菌中91.3%(21株)对CZA的MIC≤4 μg/mL，另外8.7%(2株)的菌株对CZA的MIC≥128 μg/mL。29株产金属β-内酰胺酶(MBL)的菌株对CZA的MIC值均≥128 μg/mL。见表 1。

2.2   31株CZA耐药菌株的联合药敏结果

选择对CZA耐药的31株菌进行CZA与ATM联合药敏试验，结果表明，93.5%(29株)的FIC值＜0.5，6.5%(2株)的FIC在0.5~1，显示出良好的协同和相加效应。见表 2。

2.3   不同浓度CZA对产KPC酶菌株的杀菌效果及CZA联合ATM对产NDM酶菌株的杀菌效果

CZA处理9、19、37号产KPC酶菌株，9号菌株经药物处理，在12 h后检测到显著杀菌功效。此外，用2、4和8倍MIC CZA处理，在培养24 h后，9号菌株未检测到菌落生长。19号菌株经过药物处理，在12 h后检测到显著杀菌功效，用4和8倍MIC CZA处理，8 h后细菌数为0。37号菌株用0.5倍MIC和1倍MIC CZA处理，细菌数无明显变化，用2、4和8倍MIC CZA处理12 h后细菌数为0。见图 1。CZA联合ATM的时间-杀菌曲线显示CZA和ATM的组合对27号、39号、47号产NDM酶的菌株显示出显著的杀菌功效，孵育8~12 h后未检测到菌落生长。见图 2。

图  1  不同浓度CZA对产KPC酶肺炎克雷伯菌的杀菌曲线

注：A为9号肺炎克雷伯菌，B为19号肺炎克雷伯菌，C为37号肺炎克雷伯菌。

Fig.  1  Bactericidal curve of different concentrations of CZA against KPC-producing Klebsiella pneumoniae

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图  2  CZA联合ATM对产NDM酶大肠埃希菌的杀菌曲线

注：A为27号大肠埃希菌，B为39号大肠埃希菌，C为47号大肠埃希菌。

Fig.  2  Bactericidal curve of CZA combined with ATM against NDM-producing Escherichia coli

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2.4   CZA单用及联合ATM对感染大蜡螟生存的影响

16、30号菌株的LD₈₀为1.0×10⁶ CFU/mL，22号菌株的LD₈₀为1.0×10⁷ CFU/mL。CZA联合ATM对CRE感染的幼虫具有保护作用，两药联合48 h后，幼虫的存活率稍有下降，但仍然保持在80%~90%的水平，比使用单药时的存活率(中位生存时间120 h)有大幅度提高，差异具有统计学意义(P=0.001)。见图 3。

图  3  CZA单药及与ATM联合用药后对CRE感染的蜡螟幼虫生存率曲线

注：A为16号大肠埃希菌，B为22号阴沟肠杆菌，C为30号肺炎克雷伯菌。

Fig.  3  Curve of survival rates of CRE-infected Galleria mellonella larvae after treatment with CZA alone or in combination with ATM

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3.   讨论

CRE对临床常见抗菌药物大多数耐药，可选择的抗感染治疗药物有限，成为临床棘手的问题^[8]。目前研究显示，CRE的耐药机制主要是产碳青霉烯酶，孔道蛋白缺失或表达降低而导致的外膜通透性降低，外排泵高度表达等，其中以产碳青霉烯酶在临床上最常见^[9-10]。

本研究中52株CRE菌株产碳青霉烯酶情况分析显示，肺炎克雷伯菌是以产A类丝氨酸碳青霉烯酶KPC型为主，少数菌株产B类NDM型金属酶。20株大肠埃希菌及2株阴沟肠杆菌均为产NDM型碳青霉烯酶，与我国的流行情况一致^[5]。酶抑制剂在临床治疗中起着非常重要的作用，阿维巴坦是一种新型β-内酰胺酶抑制剂，能有效、可逆的结合碳青霉烯酶中的A类丝氨酸酶及部分D类苯唑西林酶，已被应用于临床，是临床治疗CRE感染的一线选择^[11]。本研究中，23株产KPC菌株中91.3%对CZA敏感，8.7%对CZA耐药，与相关报道^[12]相近。产KPC菌株对CZA大多数敏感，但耐药菌的出现仍值得关注，耐药菌株多出现在CZA治疗后，甚至没有药物暴露史。产KPC酶的菌株对CZA耐药机制主要由bla_KPC-2中的氨基酸取代和缺失介导，突变为其他亚型，如KPC-3型等^[13]。此外，外排和孔蛋白突变增强，CTX-M或AmpC的突变也可导致CZA耐药^{[12, 14]}。29株产金属酶的菌株对CZA耐药，MIC值≥128 μg/mL。对于CZA耐药菌株的治疗，应考虑其他有效的抗菌药物或CZA与其他抗菌药物的组合。CZA联合ATM的主要机制是阿维巴坦能保护ATM免受ESBLs、AmpC酶水解，使ATM维持抗菌活性。国外已有研究^[15-16]表明，ATM联合CZA的组合能够治疗肺炎克雷伯菌(产NDM-1和OXA-48)、铜绿假单胞菌(产NDM-1和AmpC)以及阴沟肠杆菌(产NDM-1和KPC-4)引起的感染，并取得良好疗效。因携带一种或多种ESBLs，94.7%的CRE菌株对ATM耐药，但在联合阿维巴坦之后，96.9%ATM耐药菌株CZA-ATM的MIC≤1 μg/mL^[17]。在本研究中，CZA对KPC酶产生菌株表现出良好的体外杀菌效果，CZA对91.3%的菌株MIC值≤4 μg/mL。然而，其对29株MBL菌株的MIC值均≥128 μg/mL。CZA和ATM两种药物联合后，MIC值可降低至各自的敏感范围内，FIC值均＜1，表明具有良好的协同或相加效应。时间杀菌试验显示，9号菌株在0.5和1倍MIC的CZA处理后8 h，产KPC酶的菌株出现反弹生长。在2倍MIC的CZA下，菌株在处理的前4 h内稳定减少。处理12 h后未检测到菌落。对于4和8倍MIC，在处理8 h后未检测到菌落，表明适当剂量的CZA对KPC产生菌具有良好的杀菌效果。对于产NDM酶菌株，与CZA和ATM组合孵育8~12 h后未检测到菌落生长，表明该组合具有良好的杀菌功效。因此，CZA联合ATM方案可用于临床治疗NDM酶产生的CRE菌株。CZA联合ATM对CRE感染的幼虫具有保护作用，两药联合可以提高大蜡螟幼虫的生存率，16号菌株CZA单药组24 h后感染大蜡螟存活率仅为60%，而联合用药组，感染大蜡螟的存活率仍然保持100%，120 h后，CZA单药组感染大蜡螟的存活率仅为40%，而联合用药组48 h后，感染幼虫的存活率稍有下降，但仍然保持在90%的水平，并一直维持到120 h，比使用单药时的存活率大幅提高。结果表明，CZA联合ATM可延长产NDM菌感染大蜡螟的寿命并降低其死亡率。

综上所述，CZA对于产KPC的菌株具有良好的杀菌作用，并且当与ATM联合时，对基因型为bla_NDM、bla_IMP、bla_KPC+bla_IMP和bla_KPC+bla_NDM的细菌具有良好的协同杀菌作用。因此，在临床CZA或CZA联合ATM可以作为CRE感染的早期治疗选择。本研究收集的临床菌株来源于单中心，样本量较少，尤其是非产酶菌株以及除NDM外其他产金属酶菌株更少，缺乏对这部分菌株的研究结果，因此结果存在着一定的局限性。以后的工作中，扩大样本量，加大对不同耐药机制碳青霉烯类抗生素耐药菌株的深入研究，能够更好为临床抗感染联合用药提供可靠的实验室依据。