布鲁氏菌病(brucellosis，简称布病)是由布鲁氏菌引起的人兽共患传染病，是我国法定报告的乙类传染病。羊、牛、猪、鹿、犬是动物布病的主要传染源，布鲁氏菌致病性强，能通过体表黏膜、消化道和呼吸道等侵入机体，人群普遍易感，临床上以发热、多汗、乏力以及全身肌肉关节游走性疼痛等为特点^[1]。2000年以后，人间布病在我国成为报告发病数上升速度最快的传染病之一^[2]，湖南省2010—2014年共报告布病104例，全省14个地州市，除郴州市外，均有病例报告^[3]，2015年6月郴州市桂阳县报告首例病例^[4]，2016—2021年布病病例数分别为43、43、21、15、22、32例，布病由北向南快速传播，郴州布病新发病例数一跃至湖南省前列^[5-6]。本研究收集2021年郴州市确诊的布病患者的资料进行流行病学调查分析，并对布鲁氏菌分离株采用AMOS聚合酶链式反应(AMOS-PCR)进行种型鉴定，为郴州市布病防控提供依据。

1 资料与方法 1.1 资料来源

资料来源于中国疾病预防控制信息系统个案调查表、调查报告及医院电子病历，选取2021年1—12月郴州市32例布鲁氏菌病住院患者作为研究对象，病例诊断参考《布鲁氏菌病诊断》WS 269—2019^[7]。郴州市各县(市、区)人口学数据来源于2021年郴州市统计年鉴。

1.2 方法 1.2.1 细菌培养与血清学鉴定

取患者血液8~10 mL，骨髓或组织脓液约5 mL。静脉血培养采用全自动血培养仪，在血培养仪提示阳性后，将其接种于血平板，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养2~3 d。如革兰染色阴性并且培养出现微小、无色、凸起、不溶血菌落，则高度怀疑布鲁氏菌。将疑似布鲁氏菌感染患者的血清标本送往当地疾病预防控制中心进行血清学检测确诊。先进行虎红平板凝集试验(RBPT)，针对结果呈阳性的标本，再使用试管凝集试验(SAT)复检，滴度＞1∶100判断为血清学阳性。

1.2.2 菌株种型鉴定

布鲁氏菌在布氏琼脂上37℃培养48 h后，按照细菌基因组DNA提取试剂盒所附的操作说明书，提取布鲁氏菌基因组DNA。采用布鲁氏菌属特异性PCR(BCSP31-PCR)鉴定菌属、AMOS-PCR鉴定布鲁氏菌种。BCSP31蛋白存在于布鲁氏菌属各个种及各生物型菌株中，根据BCSP31核苷酸序列设计的引物用于布氏菌属的鉴定。AMOS-PCR是针对IS711元件的种特异性插入序列的PCR试验，用于鉴定羊种、牛种、猪种及绵羊附睾种布鲁氏菌。引物序列和PCR扩增程序参考文献[7]操作。

1.2.3 菌株分型方法

分离菌株通过单相特异性血清(A/M)凝集试验、硫化氢(H₂S)产生、初代分离培养时CO₂需求、染料(硫堇/碱性复红)抑菌试验、噬菌体(TB和BK2)裂解试验等进行种/型鉴定，可鉴定羊种(1、2、3型)、牛种(1、2、4型)、猪种(1型)布鲁氏菌。布鲁氏菌血清分型检测试剂盒(A、M、R各1支，青岛中创汇科)可初步鉴定布鲁氏菌生物型。鉴定方法参照《布鲁氏菌病诊疗及防控手册》^[8]。

1.3 统计学方法

应用Excel 2007软件对数据进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示，计数资料采用例数及百分数表示。

2 结果 2.1 发病人群基本特征

郴州市2021年共报告布病32例，病历资料完整，其中男性26例、女性6例，男女比例为26∶6；发病年龄为(51.13±13.33)岁，年龄最小29岁，最大87岁；患者均为散发病例，全市11个县(市、区)，桂东县、安仁县无病例，全年除1、10、12月，均有布病报告病例。患者从发病到诊断间隔时间＜6 d 23例，6~＜15 d 6例，15~30 d 3例。32例布病患者基本特征见表 1。

2.2 流行病学特征 2.2.1 时间分布

郴州市5月份报告布病例数最多(7例)；7月份报告6例，3、6、9月份各报告布病4例；布病病例主要集中在3—9月，共29例，占总病例数的90.63%。见图 1。

2.2.2 地区分布

郴州市11个县(市、区)中，临武县、桂阳县、嘉禾县发病率排前3位，分别为3.72/10万、0.99/10万、0.87/10万，发病数分别为12、7、3例，共计22例，占总病例数的78.13%。见表 2。

2.3 主要临床表现

32例布病病例中，发热32例(100%)，乏力29例(90.63%)，多汗27例(84.38%)，头痛26例(81.25%)，伴腰腿关节痛21例(65.63%)，肝、脾及淋巴结肿大13例(40.63%)。

2.4 实验室检验 2.4.1 血清学检验

直接取患者血清，RBPT与SAT结合，血清滴度＞1∶100，确诊布病10例；通过细菌培养分离出疑似布菌菌株，再采用RBPT与SAT，血清滴度＞1∶100，确诊布病22例。生化检验：血沉(ESR)升高28例，C反应蛋白(CRP)升高27例，乳酸脱氢酶(LDH)升高26例，天冬氨酸转氨酶(AST)升高22例、丙氨酸转氨酶(ALT)升高18例。

2.4.2 分子生物学试验

14例布病患者血培养分离布鲁氏菌，BCSP31-PCR试验证实布鲁氏菌属阳性14例，AMOS-PCR证实4~17号为布鲁氏菌羊种(bp731)。均来源于郴州市第一人民医院住院病例(临武县7例、桂阳县2例、嘉禾县2例、北湖区2例、苏仙区1例)，产物电泳结果见图 2。

2.4.3 A、M、R布鲁氏菌分型诊断试剂盒检测

14株羊种布鲁氏菌菌株，14株血清学凝集试验：A+和M+，R-，初步诊断为羊种3型。

2.5 治疗效果

急性期患者住院期间多采用多西环素(100 mg/次，2次/d，6周)+利福平(600~900 mg/次，1次/d，6周)或多西环素(100 mg/次，2次/d，6周)+链霉素(15 mg/kg，1次/d，2~3周)，难治性病例采用多西环素+利福平+喹诺酮类或第三代头孢菌素类抗生素，总疗程至少12周，期间监测血常规、肝肾功能变化，经过早期、联合、足量、足疗程用药治疗后，预后良好。

3 讨论

布病是由布鲁氏菌属细菌侵入机体引发的传染-变态反应性人兽共患传染病，近年来疫情不断暴发，已成为一项重要的公共安全问题，尤其在我国南方大部分地区，越来越多的县(区)出现布病疫情^[9]。2015年郴州市桂阳县报告首例布病病例^[4]，郴州市布病疫情不断蔓延，发病数跃居湖南省前列^[5-6]，2021年郴州市报告布病32例，14株布鲁氏菌AMOS-PCR鉴定为羊种，A/M凝集试验初步鉴定为羊种3型，与国内报道的布病流行的优势菌种型一致^[10]。郴州市布病病例高度散发，病例以中青年男性农牧民为主，可能与男性参与牲畜饲养、屠宰、运输等相关工作多，与传染源接触机会多有关。布病新发病例数从3月开始增多，5月达到高峰后下降，可能是因为羊的繁殖季节一般在2~4月份，在产羔季节人接触布病病畜机会增加，且产羔后开展免疫接种等活动，接触机会多，容易发病^[11]。布病传染性强，少量病原体就存在高度传染性，可导致布病肆虐^[12]，研究^{[5, 13]}表明郴州市医院检验人员、动物防疫人员可在工作期间感染布病，提示需要加强布病防控及个人防护知识的宣传。未直接接触牲畜的非职业人群感染布病9例，占28.13%，提示气溶胶、食源性等非传统途径感染有上升趋势^[14-15]。

布鲁氏菌培养是诊断布病的金标准，常通过血培养检出布鲁氏菌来判断，但培养耗时较长，一般需3~5 d。本文局限性为布鲁氏菌菌株标本量较少，未对14株菌株进行传统生物学方法分型，主要原因是布鲁氏菌传染性极强，涉及抗原制备的大量活菌操作需在三级生物安全实验室进行。《布鲁氏菌病诊断标准(2019)》中增加了布鲁氏菌实验室生物安全要求，标准规定病原菌分离纯化、药敏试验、生化鉴定、PCR核酸提取等可以在二级生物安全实验室操作。

由于布病临床表现不典型，易被误诊为流感等上呼吸道感染、结核病、风湿性关节炎等疾病，郴州市仍有少数布病病例从发病到确诊的间隔时间超过15 d。郴州市25%的布病病例由县级医院确诊，还需加强对基层医疗机构医务人员布病诊疗及防控知识的培训。研究^[16-18]显示，呼吸系统受损布病患者的血培养阳性率为20%~50%，通过发现ESR、CRP、LDH、AST、ALT出现升高，结合RBPT试验可对布病进行初步诊断，对长期出现不明原因发热、多汗、肌肉骨骼痛的患者，临床医生要结合流行病学史，ESR、CRP升高，考虑布病的可能性。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。