金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是引起医院感染和社区获得性感染常见病原体之一，主要引起皮肤软组织感染、心内膜炎、骨髓炎、菌血症和致死性肺炎等多种疾病[1-2]。SA通常可以无症状定植于30%~50%人群的前鼻孔，且SA鼻腔携带者的感染风险是非携带者的2~12倍[3]。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)等耐药菌株在全球范围内出现，是导致患者病死率增加的主要原因，同时加重了社会经济负担[4-5]。由于SA对大多数常用抗菌药物耐药，给医疗机构带来了巨大负担，因此，世界卫生组织将SA列为优先级Ⅱ类病原体[6]。人体大约80%的慢性和复发性感染由细菌生物被膜引起[3]，SA是生物被膜感染常见的病原体之一[7]。文献[8]报道，43%~88%的SA临床分离株可以形成生物被膜。细菌生物被膜具有很强抗药性，能够帮助细菌逃避抗菌药物的杀伤，也是SA产生耐药性的重要原因[9]。研究[10]表明，86.7%产生生物被膜的SA具有多重耐药性。因此，SA生物被膜相关感染是全球公共卫生领域的主要关注点之一。生物被膜导致治疗困难是当前面临的难题，其耐药机制还有待进一步阐明。目前，尚无有效的针对生物被膜的治疗方法[11]。本文就SA生物被膜耐药机制研究的最新进展作一综述，旨在为开发针对SA生物被膜新的治疗方法提供思路，为生物被膜耐药相关研究提供参考依据。
1 SA生物被膜概述细菌生物被膜是附着在生物和非生物表面的微生物种群组成的细胞外结构，表面包裹有细菌分泌的聚合物如胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)、细胞外DNA(extracellular DNA, eDNA)、蛋白质等细胞外基质(extracellular matrix, ECM)成分[12]。影响SA生物被膜耐药性的相关因素较多，包括生物被膜基质成分与抗菌药物的相互作用，生物被膜的异质性，持久细胞(persister cells)的出现，外排泵(efflux pump，EP)的表达增加，抗菌药物抗性基因的种间转移等。
2 SA生物被膜耐药性产生机制 2.1 eDNA增强细菌耐药性eDNA是SA生物被膜基质的主要成分，不仅可以增加生物被膜结构的稳定性，还可以增加对带正电荷抗菌药物(电荷的正负受微环境pH影响)的耐药性[13-14]。SA在生物被膜成熟期间发生裂解并释放基因组DNA，是eDNA形成的主要原因，但具体形成机制未完全阐明[13, 15]。SA一般通过自溶素A介导的自溶(裂解的一种方式)释放eDNA，但低抑制剂量的抗菌药物通过杀死一小部分细菌也可以刺激eDNA的释放[16]。eDNA作为阴离子可螯合和中和阳离子杀菌分子，包括氨基糖苷类、青霉素G等抗菌药物和防御素、乳铁蛋白等抗菌肽，并限制阳离子抗菌剂的扩散[17]。带负电荷的eDNA可以通过降低电化学梯度降低对氨基糖苷类药物、四环素类药物和大环内酯类药物的敏感性[18]。如万古霉素和eDNA的结合常数比万古霉素和其靶标肽聚糖前体中D-Ala-D-Ala肽的结合常数高100倍，导致万古霉素消耗在生物被膜ECM中[18]。此外，eDNA能够酸化局部环境，促进抗菌药物耐药表型的产生[19]。eDNA还参与基因水平转移(horizontal gene transfer，HGT)，即基因组之间遗传信息的非接合性转移[15]。因此，eDNA可以作为有价值的抗生物被膜靶标。
2.2 持久细胞对抗菌药物的耐受作用持久细胞与SA生物被膜的抗菌药物耐受性有关，是生物被膜相关复发性感染的主要原因[20]。持久细胞是一种短暂耐抗菌药物的细菌细胞，通常生长缓慢或生长受阻[21]。在生物被膜相关感染中，抗菌药物可以清除生物被膜内的大部分细菌，包括从生物被膜中脱离的细菌，其余的可以被免疫系统清除，但是留在内部或基部的持久细胞很难被抗菌药物清除[22]。SA持久细胞内电子传递链的缺陷导致色素沉着，细胞壁合成、生长、呼吸等过程的减少和外毒素的产生，进而降低通过靶向这些细胞过程发挥杀菌活性的抗菌药物(如β-内酰胺类药物)的功效，使持久细胞对抗菌药物具有耐受性[23]。SA生物被膜内的高细胞密度环境，氧气、营养的缺乏和细胞内ATP浓度降低，SOS反应的启动和毒素-抗毒素(toxin-antitoxin, TA)系统基因的表达等均能促进持久细胞的产生[24]。TA系统是持久细胞产生的主要因素，而ATP浓度下降似乎是SA持久细胞在抗菌药物作用下存活的主要因素[20]。长期抗菌治疗促进持久细胞产生，导致慢性感染反复出现[22]。抗菌治疗对持久细胞的“致命弱点”，是重新激活与生物被膜相关的慢性感染的关键因素，一旦撤销抗菌药物，充当疾病储存库的持久细胞就可以重新激活、分裂繁殖并出现感染[22, 25]。因此，清除持久细胞可能是消灭生物被膜相关慢性和复发性感染的关键步骤。
2.3 HGT介导细菌产生耐药性HGT允许抗性基因转移到其他种类的细菌内，是已知的新抗性基因传播的主要机制，促进细菌耐药性的快速传播[26]。耐药基因的水平转移是生物被膜内的细菌对抗菌药物耐药的重要作用机制之一。生物被膜内稳定的物理环境、高细胞密度、增强的遗传能力和积累的可移动遗传元件，为有效的HGT(包括对耐药基因的摄取)提供了理想的环境[27]。细菌可以通过接合、转导和自然转化来获取和整合新的基因[28]。大多数SA可被噬菌体溶源化，噬菌体转导是SA中常见的HGT机制[29]。整合子是由整合酶基因、特异性重组位点和启动子组成的遗传元件。通过整合子调节抗生素抗性基因是生物被膜通过HGT增强获得抗微生物抗性的决定因素[30]。研究[25]表明，SA生物被膜可通过接合或非接合性质粒的传递导致质粒携带的抗生素抗性基因传播。SA在生物被膜状态下的多药抗性质粒的接合转移频率比浮游状态高10 000倍，这可能是由于生物被膜内的细菌位置相对固定和邻近[31]。生物被膜中细胞与细胞的紧密接触为HGT创造了有利条件，生物被膜的形成增加SA通过HGT获得和传播携带耐药基因质粒的能力[32]。因此，为预防和控制生物被膜内SA通过抗性基因的水平转移增强耐药性，需要探索新的治疗靶点或组合疗法。
2.4 群体感应(quorum sensing, QS)增强细菌耐药性QS是细菌细胞间信号传导的过程，依赖于被称为自诱导剂的细胞外信号分子的产生、检测和响应[33]。细菌QS信号主要由酰基高丝氨酸内酯(acyl-homoserine lactone, AHL)、自体诱导肽(autoinducing peptide, AIP)和自体诱导物Ⅱ类分子(autoinducer-2, AI-2)组成，参与细菌的各种生理过程，包括生物被膜形成，质粒接合、运动和抗菌药物抵抗[34]。一方面，QS系统能够调节生物被膜形成基因，也能调节细菌耐药相关基因[35]。细菌可以通过QS系统调节，从单个细胞转变为多个细胞协同的方式生存，进而转变为生物被膜生长模式以抵抗或逃避抗菌药物的杀伤[36]。另一方面，QS系统可以调节EP基因的表达，而EP可以有效地将抗菌药物从细菌体内排出，从而在耐药过程发挥重要作用[35]。辅助基因调控(auxiliary gene regulation, Agr)QS系统是SA致病性的中心调节器，在细菌成熟、生物被膜的扩散中起关键作用，并有助于形成新的定植位点[37]。研究[30]表明，抑制SA生物被膜中RNAIII激活肽的靶标(target of RNAIII-activating peptide, TraP)QS受体，可减少细菌细胞壁肽聚糖合成和基质中eDNA含量，显著提高头孢菌素、万古霉素、达托霉素、利奈唑胺、妥布霉素和夫西地酸对SA的抗菌效果。
2.5 EP导致细菌对抗菌药物产生耐药性EP在各种细菌中广泛存在。细菌EP是一种存在于细胞膜上，从细胞膜内外质子或离子(如钠)形成的化学梯度中获取能量的二级主动转运蛋白，可将大部分临床相关的抗菌药物从细菌内部排到细胞外，是细菌对抗菌药物产生耐药性的关键机制[38]。EP在生物被膜发育中也发挥了重要作用：(1)辅助QS分子和群体淬灭(quorum quenching, QQ)分子外流促进生物被膜基质的形成；(2)间接调节生物被膜形成相关基因的表达[39]。在包含SA的革兰阳性菌中，主要协同转运蛋白超家族(major facilitator superfamily, MFS) 在五个主要的EP家族中发挥重要作用[40]。SA MFS中的NorA EP作为SA最有效的耐多药系统，可排出氟喹诺酮类抗菌药物和季铵化合物，MepA EP也可排出氟喹诺酮类等不同类别的抗菌药物[40-42]。在生物被膜生长过程中，SA中EP基因mdeA、norB和norC的相对表达水平上调，其中norB和norC EP可以排出胞内的西曲米和喹诺酮类等抗菌药物，而MdeA EP可排出胞内的季铵化合物(表面消毒剂)和抗菌药物[43]。
3 结语SA生物被膜对多种抗菌药物耐药，感染后患者发病率和病死率显著增加，给临床抗感染治疗带来严峻挑战。本综述旨在分析SA生物被膜在抗菌药物耐药性增加过程中的作用并介绍相关机制。尽管目前已经对铜绿假单胞菌(研究最多的生物被膜模式菌)生物被膜进行了大量研究，但是对SA等其他细菌生物被膜的研究相对较少。不同细菌生物被膜在耐药性产生方面存在很大差异，SA作为细菌生物被膜感染中最常见的病原体之一，目前尚未探索出针对其生物被膜相关感染的有效治疗策略。因此，需对SA生物被膜的耐药机制进行更多研究。SA生物被膜耐药机制及具体过程仍不清楚，分析SA生物被膜耐药的具体机制，有助于制定与其感染相关的新治疗方案和策略。
利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。
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