2. 成都医学院 药学院, 四川 成都 610500;
3. 成都市金牛区人民医院 西药剂科, 四川 成都 610500;
4. 成都医学院临床医学院 第一附属医院药学部, 四川 成都 610500;
5. 广元市中医院临床药学办, 四川 广元 628099
2. School of Pharmacy, Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China;
3. Department of Pharmacy, Chengdu Jinniu District People's Hospital, Chengdu 610500, China;
4. Department of Pharmacy, First Affiliated Hospital, Chengdu Medical College Clinical School, Chengdu 610500, China;
5. Clinical Pharmacy Office, Guangyuan City Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangyuan 628099, China
鲍曼不动杆菌是一种机会性致人类感染病原体，在危重患者中易引起呼吸机、血液和留置装置感染等问题[1]，该病原体生物被膜的形成有助于医疗器械相关感染及感染持续[2]，同时生物被膜的形成使其耐药性与致病性大幅度增强[3], 导致持续性感染与反复感染的出现[4-6]，使治疗感染面临巨大的挑战。研究[7-8]表明, 生物被膜的形成与外排泵系统、群体感应系统、胞外多糖等相关。本文重点探讨多重耐药鲍曼不动杆菌AYE杆菌RND外排泵基因影响生物被膜形成的作用机制。
1 材料与方法 1.1 菌株来源鲍曼不动杆菌标准菌株AYE，以及RND外排泵基因敲除AYE菌株(分别为AYE△ adeB、AYE△ adeFGH、AYE△ adeIJK)，均为本实验室留存，并对其进行验证。
1.2 试验仪器及试剂信息 1.2.1 试验仪器恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)、生物安全柜(Thermo Fisher Scientific)、恒温摇床(Thermo Fisher Scientific)、酶标仪(SpectraMa190)、荧光定量PCR仪(biorad)、正置显微镜(Thermo Fisher Scientific)、96孔细胞培养板(科兹莫生物科技有限公司)等。
1.2.2 试剂信息胰酪大豆胨液体培养基和CAMHB肉汤培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)，维拉帕米(购自大连美仑生物公司)，奥美拉唑(购自源叶生物)，二甲基亚砜(购自成都市科龙化工试剂厂)，PAβN和CCCP(购自上海皓元生物医药科技有限公司)，PBS和RNA提取试剂盒(购自生工生物)、逆转录试剂盒和荧光染料SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(购自诺维赞)。
1.3 试验方法 1.3.1 基因敲除使用无标记基因敲除方法[9]分别敲除鲍曼不动杆菌AYE菌株RND外排泵基因adeB、adeFGH、adeIJK基因，具体方法参考文献[10]。构建应敲除基因的上下游同源序列，以Not1和BamH1双酶切后插入自杀性载体pMo130-Telr，进行热击转化，将携带同源片段的自杀式载体转入电转感受态菌株47055，与标准菌株AYE混合浓集于NC膜上，然后进行筛选鉴定，直至筛选出对应敲除基因突变株，进行测序及实时定量确认。
1.3.2 验证基因敲除情况用实时定量聚合酶链反应[11](qRT-PCR)验证AYE菌株RND外排泵基因敲除情况。引物序列见表 1。提取AYE菌株及基因敲除菌株RNA，并逆转录成cDNA，一式三份测定外排泵基因adeB、adeG、adeJ的表达水平。实时定量(qRT)-PCR在10 μL总反应体积中进行(2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL，引物正向、反向各0.2 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 4.1 μL)，qRT-PCR的循环过程如下：95℃ 30 s，然后95℃ 5 s循环40次，60℃ 10 s，72℃ 20 s。管家基因16S rRNA作为内参，靶基因表达水平的倍数变化由2 -ΔΔC Ť 方法计算[12]。
| 表 1 qRT-PCR检测外排泵基因表达引物及产物长度 Table 1 Primers and length of products for qRT-PCR detection of efflux pump gene expression |
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4种外排泵抑制剂包括PAβN、奥美拉唑、维拉帕米、CCCP，其中PAβN、奥美拉唑、维拉帕米的MIC值均>512 μg/mL，CCCP MIC值为16 μg/mL。最终选择不影响细菌生长的最大浓度, PAβN、奥美拉唑、维拉帕米为1/4最低抑菌浓度(MIC)(128 μg/mL)，CCCP为1/2 MIC (8 μg/mL)。
1.3.4 生物被膜形成试验使用结晶紫染色法[13]测定鲍曼不动杆菌生物被膜形成情况：以标准菌株AYE作为对照菌株，每个菌株设置6个复孔，用0.9%生理盐水调整其光学密度为OD600=0.1，接种到96孔细胞培养板中，培养板在37℃静置培养24 h。用PBS清洗3遍去除浮游细菌，静置30 min使96孔板晾干；每孔加入200 μL 0.1%结晶紫，染色15 min。将结晶紫轻轻吸出，每孔用无菌PBS轻轻洗3次，静置30 min使96孔板晾干；在每孔中加入200 μL 95%的乙醇溶液，静置15 min，使结晶紫完全溶解，测定OD570。
1.4 统计分析应用SPSS 20.0和Graphpad Prism 8.0.2软件对数据进行统计分析和作图，定量资料以(x±s)表示，采用t检验进行统计分析，P≤0.05认为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 基因敲除情况qRT-PCR检测AYE菌株RND外排泵基因adeB、adeFGH、adeIJK基因均成功敲除，获得AYE△ adeB、AYE△ adeFGH、AYE△ adeIJK菌株。以16S rRNA基因作为内参基因，鲍曼不动杆菌标准菌株AYE的RND外排泵基因敲除前后的表达情况，AYE菌株RND外排泵基因敲除菌株AYE△ adeB、AYE△ adeFGH、AYE△ adeIJK对应基因已经成功敲除。见图 1。
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| 图 1 鲍曼不动杆菌标准菌株AYE外排泵基因敲除后相关基因表达情况 Figure 1 Expression of related genes after knockout of efflux pump genes of Acinetobacter baumannii standard strain AYE |
外排泵基因敲除后AYE△adeB、AYE△ adeFGH、AYE△ adeIJK菌株生物被膜形成量分别为1.59±0.06、2.15±0.19、1.91±0.02，其中外排泵基因adeFGH敲除后生物被膜形成量与敲除前(AYE: 2.31±0.01)相比，差异无统计学意义(P>0.05)，adeB和adeIJK基因敲除后生物被膜形成量低于敲除前(AYE: 2.31±0.01)，差异均有统计学意义(均P < 0.05)。见图 2。
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| *：表示P < 0.05。 图 2 鲍曼不动杆菌标准菌株AYE外排泵基因敲除菌株生物被膜形成情况 Figure 2 Biofilm formation of efflux pump gene knockout strains of Acinetobacter baumannii standard strain AYE |
在4种外排泵抑制剂作用下，鲍曼不动杆菌标准菌株AYE的生物被膜形成量(PAβN、奥美拉唑、维拉帕米、CCCP分别为2.14±0.03、2.24±0.02、1.93±0.05、2.09±0.04)均低于对照组(AYE: 2.31±0.01)，差异均有统计学意义(均P < 0.05)，其中PAβN形成量最少。见图 3。
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| *：表示P < 0.05。 图 3 4种外排泵抑制剂对鲍曼不动杆菌标准菌株AYE生物被膜形成的影响 Figure 3 Effect of 4 efflux pump inhibitors on biofilm formation of Acinetobacter baumannii standard strain AYE |
生物被膜是附着在生物或者非生物表面的复杂微生物群落，其产生主要涉及四个阶段[14]，第一阶段：初始黏附，细菌细胞凭借其动力系统附着在物体表面；第二阶段：形成微菌落；第三阶段：生物被膜的生长和成熟：第四阶段：细菌细胞的释放。生物被膜的附着由菌毛系统介导，随着微菌落的形成，开始产生群体感应(quorum-sensing，QS)信号因子[15]，同时胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)、淀粉样纤维、脂质和核酸等共同构成了生物被膜的细胞外基质，这些因素共同影响着生物被膜的形成与成熟。外层的胞外多糖，为生物被膜的产生和持续提供了物理屏障，QS是一种细胞间的通信机制，可以根据细胞密度同步生物被膜相关基因的表达[16]。同时由于外排泵能够减少生物被膜内部代谢废物的积累与细菌密度的增加。研究[17-18]表明，外排泵在一定程度上影响着生物被膜的形成。
鲍曼不动杆菌耐药性形成过程中RND外排泵发挥着重要作用[19-20]。比较鲍曼不动杆菌标准菌株AYE的外排泵基因adeB、adeFGH、adeIJK敲除前后生物被膜形成情况，结果表明，AYE△ adeB、AYE△ adeIJK生物被膜形成量明显降低，而AYE△ adeFGH生物被膜形成降低量与对照组相比差异无统计学意义。
在4种外排泵抑制剂作用下，鲍曼不动杆菌标准菌株AYE的生物被膜形成量均有不同程度降低，其中PAβN的降低效果最明显。PAβN是一种广谱的外排泵抑制剂[21]，与adeB外排蛋白相结合，PAβN利用远端结合袋中Phe残基形成的疏水微环境，使结合单体保持结合构象，防止外排泵挤出任何其他底物，从而导致泵的多重抑制。CCCP为质子动力解偶联剂[22]，奥美拉唑为H+-K+-ATP酶(又称质子泵)抑制剂，主要通过破坏跨膜电化学梯度，从而阻断外排泵能量来源，影响药物的外排；维拉帕米与膜糖蛋白结合发挥作用，但其逆转活性不强。4种外排泵抑制剂通过不同的作用机制对外排泵进行抑制后对生物被膜形成的影响程度也不尽相同，其中PAβN作为广谱外排泵抑制剂对生物被膜的抑制作用最明显，其次为维拉帕米、奥美拉唑和CCCP4种外排泵抑制剂均能使生物被膜形成减少。
综上所述，外排泵基因adeB、adeFGH、adeIJK对多重耐药鲍曼不动杆菌AYE生物被膜的形成有重要作用，外排泵抑制剂PAβN、奥美拉唑、维拉帕米、CCCP对鲍曼不动杆菌AYE生物被膜的形成有不同程度的抑制作用。由于本文仅对外排泵相关基因进行敲除与检测，未对生物被膜的其他影响因素，如QS系统、EPS等进行深入的研究，有一定的局限性，但外排泵基因敲除后生物被膜的减少表明外排泵基因在生物被膜形成中的重要作用，且外排泵抑制剂对生物被膜形成的抑制作用为临床鲍曼不动杆菌生物被膜相关治疗提供了一种新的思路。
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