铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是医院感染常见非发酵革兰阴性机会致病菌。PA与宿主作用复杂，能产生外毒素、弹性蛋白酶、鼠李糖脂、绿脓素及外源凝集素等多种毒力因子，并对多种抗菌药物天然或获得性耐药，被认为是最危险的病原菌之一^[1-2]。目前，临床上抗菌药物不合理使用情况较为常见，导致PA对各种抗菌药物的耐药性演变更快^[3-4]，使得多重耐药PA(multidrug-resistance，MDR-PA)、泛耐药PA(extensive drug-resistance，XDR-PA)、耐碳青霉烯类PA(carbapenem-resistance，CRPA)的检出率逐年增高。此类菌株所致感染病情重，病死率高，是当前困扰抗感染治疗的严重问题^[5-6]。本研究回顾性分析上海某三甲医院PA菌株的临床分布，并确定其多重耐药菌株流行情况，为PA感染的经验性治疗, 抗菌药物合理选择及感染控制提供依据。

1 材料与方法 1.1 菌株来源

收集2014年1月—2017年12月上海某三甲医院送检的各类感染标本中分离的非重复PA。该院现核定床位数1 800余张，年度收治门急诊患者400万余人次，出院人数12万余，住院手术9万余人次。

1.2 试剂及仪器

哥伦比亚血琼脂、麦康凯、巧克力和水解酪蛋白平板为上海科玛嘉微生物技术有限公司产品，VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统及配套鉴定、药敏卡为法国生物梅里埃公司产品，药敏纸片购自英国Oxoid公司。

1.3 细菌鉴定及药敏试验

送检标本分别接种哥伦比亚血琼脂和麦康凯平板，呼吸道标本再增加接种巧克力平板，35℃ 5% CO₂环境培养过夜^[7]。对培养出的可疑菌落进行PA鉴定。纸片扩散(K-B)法和仪器法对菌株进行药物敏感性检测，依据美国临床实验室标准化协会(CLSI)2017年折点标准判断药敏结果。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 35218和铜绿假单胞菌ATCC 27853，由上海市临床检验中心提供。

1.4 MDR-PA、XDR-PA和CRPA的定义

定义MDR-PA、XDR-PA的8类抗菌药物为氨基糖苷类、抗假单胞菌碳青霉烯类、抗假单胞菌头孢菌素类、抗假单胞菌氟喹诺酮类、抗假单胞菌β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合物类、单环β-内酰胺类、磷霉素类和脂肽类(粘菌素、多粘菌素B)，其中3类或以上(每类中1种或以上)不敏感为MDR-PA，6类或以上(每类中1种或以上)不敏感为XDR-PA^[8]，对任何碳青霉烯类抗生素(亚胺培南和美罗培南)耐药即定义为CRPA。因本院临床未常规检测PA对磷霉素和脂肽类的敏感性，因此本研究计算MDR-PA和XDR-PA数量时未予考虑。

1.5 统计学分析

应用WHONET 5.6软件分析菌株分布和耐药性。应用SPSS 22.0软件对痰与非痰标本药敏结果进行卡方检验，P≤0.05为差异有统计学意义。采用拟合函数曲线判断菌株数量随年份、性别变化趋势。

2 结果 2.1 菌株分离情况

2014—2017年全院共分离菌株11 177株，其中PA 1 218株(占10.9%)。采用一元线性回归方程(R²=0.854，P=0.076)分析PA菌株数量变化，总体呈逐年上升趋势。见图 1。

2.2 标本来源

尿标本分离菌株最多(4 900株，占43.8%)，其次为痰(3 199株，占28.6%)。914株PA分离自痰标本，占PA株数的75.0%，占痰中分离菌株数的28.6%；129株PA分离自尿标本，占PA株数的10.6%，占尿中分离菌株数的2.6%；血是PA分离的主要无菌部位标本之一，占2.3%。见表 1。

2.3 科室分布

2014—2017年泌尿外科分离病原菌最多(2 351株，占21.0%)，其次为老年医学科和门诊，分别为1 470株(13.2%)和1 206株(10.8%)，重症监护病房(ICU)位列第四(6.7%)。PA主要分离自老年医学科，占PA菌株的44.9%，占该科室分离菌株数的37.2%；ICU和呼吸科PA各108株，各占PA菌株的8.9%，分别占两科室分离菌株数的14.4%和24.9%。见表 2。

2.4 年龄及性别分布

1 218株PA中，952株(78.2%)分离自男性患者。81~90岁年龄段是PA最多见的分离人群(319株，26.2%)，其次为>90、61~70、71~80岁年龄段人群，分别占21.3%、19.0%、12.7%。男性患者分离菌株数随年龄变化采用幂函数曲线拟合，结果显示随年龄增长菌株分离率显著上升(P < 0.001)；女性患者采用二次函数曲线拟合，结果显示随年龄增长菌株分离率也增长(P=0.045)，并在61~70岁年龄段后呈现下降趋势。见图 2。

2.5 MDR-PA、XDR-PA和CRPA分离率

2014—2017年PA菌株中，MDR-PA、XDR-PA、CRPA分离率分别为30.5%、2.5%、38.8%，均以2017年分离率最高，分别为35.7%、4.3%和47.5%。此外，4年间痰标本中MDR-PA、CRPA的分离率均高于非痰标本(均P＜0.05)，但XDR-PA则差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 3。MDR-PA、XDR-PA和CRPA分布均以痰(分别为85.5%、76.6%和83.5%)、尿(分别为6.5%、10.0%和7.6%)为主，临床科室分布以老年医学科(分别为63.2%、46.7%和56.9%)和呼吸科(分别为11.3%、16.7%和9.9%)最常见。见表 4。

3 讨论

本研究中，PA痰中检出最多，与呼吸道为其常见的感染部位结果^[9-10]一致，可能与PA易于定植呼吸道有关。当机体免疫力下降时，细菌侵袭，损伤肺部机能，痰液难以排出，导致PA积聚并大量繁殖^[11]。尿标本PA分离率仅次于痰，提示该菌也易引起尿路感染^[9]，可能与尿潴留、尿路结石、生殖系统病变及留置导尿管等高危因素有关^[12]。

PA在老年医学科检出率居首位，可能与老年患者机体基础条件差、长期卧床、病情复杂及常伴有多器官功能衰竭有关。另外，长期抗菌药物和糖皮质激素治疗破坏机体免疫系统，病房环境复杂导致多种病原菌交叉传播，以及反复感染也是老年科PA多见的可能因素。ICU患者起病急、病情重及长期大剂量使用抗菌药物，导致人体正常菌群紊乱并筛选出耐药菌株，与该科PA分离率偏高有关^[13]。呼吸科患者多有肺部功能受损，致使细菌清除能力下降，加上机械通气等创伤性治疗措施破坏患者自身防御机制，为PA生存提供了合适的环境^[9]，与本研究该科PA分离率较高一致。另外，本研究显示，PA更易分离于老年男性患者，其原因可能与男女间卫生习惯、皮肤表面细菌数量和种类差异，以及老年患者免疫功能弱、感染愈后差有关^[14-15]。

PA具有快速获得多重耐药的能力，使该菌感染具有较高的发病率和病死率，且治疗困难^[2]。PA耐药机制比较复杂，常见的有产头孢菌素酶和β-内酰胺酶、外膜通透性降低、产磷酸转移酶和乙酰转移酶、拓扑异构酶Ⅱ和Ⅳ改变、主动外排系统过表达等^[2]。当前，PA多重耐药菌株已在世界范围内流行，欧洲30个国家参与的抗菌药物耐药监测数据显示，MDR-PA的分离率为0~49.4%，其中16个国家＜10%，11个国家为10%~25%，3个国家＞25%；美国MDR-PA占13%~19%，伊朗MDR-PA平均分离率高达58%^[16-17]。尽管国内有MDR-PA的报道，但CHINET中国细菌耐药监测网并没有关于MDR-PA的相关数据^{[8, 18]}。本研究中，MDR-PA占30.5%，此数据低于韩国(50%)、土耳其(60%)、埃及(36%)和印度(36.2%)^[2]。另外，本文中XDR-PA占2.5%，尽管比率较低，但呈逐年递增趋势，提示在本院治疗PA时需要密切关注抗菌药物的合理使用。过渡使用广谱抗菌药物也容易导致全耐药(pan-drug resistance，PDR)菌株的产生。CHINET PA耐药性监测数据显示，PDR-PA的分离率为0.9%~1.7% ^{[9, 18]}。本研究虽因个别抗菌药物未能进行常规药敏试验而不能统计PDR-PA的发生率，但30.5%的MDR-PA和2.5%的XDR-PA提示PDR-PA存在的可能性很大。本研究中CRAP的检出率为38.8%[亚胺培南耐药率为27.3%，美罗培南耐药率为24.7%]，高于2017年CHINET监测网数据(亚胺培南耐药率为23.6%和美罗培南耐药率为20.9%)^[18]，因此使用该类药物治疗PA感染时应严格监测CRAP分离情况。

文献^[19-20]显示，磷霉素和多粘菌素类药物联用对PA具有协同杀灭作用，可能成为治疗MDR-PA、XDR-PA、CRPA感染的新思路。多粘菌素是治疗XDR-PA的少数可供选择的抗生素，绝大部分菌株对其敏感，由于该药敏感性检测必须测其MIC值，故本院未能常规开展其敏感性试验。2017年CHINET监测网数据中PA对多粘菌素耐药率为0.9%，尽管很低，但表明临床已经存在对该药耐药的PA。

本研究显示，MDR-PA、XDR-PA、CRPA尤其多见于痰标本，可能是痰标本多来自于基础疾病严重患者较多的病区，如老年医学科、呼吸科、神经外科等，复杂感染长期使用抗菌药物，导致筛选出耐药菌株；而非痰标本多为尿和无菌体液，所处环境较单一，发生筛选和交叉感染的概率相对较低^[18]。另外，PA具有荚膜多糖，极易定植于呼吸道，而临床上多采集患者痰标本送检，检出PA后即使用抗菌药物治疗，导致菌株耐药筛选压力进一步加重。

综上所述，本院MDR-PA、CRPA分离率高，在今后的临床工作中，应强化医务人员医院感染防控意识，加强医院感染防控，根据药敏试验结果选药和使用新型抗菌药物治疗，以减少MDR-PA、XDR-PA、CRPA的产生与传播。另外，针对磷霉素和多粘菌素类药物应常规开展药敏试验，以弥补实验室对临床用药选择支撑不足的缺陷。